转印电泳湿转方式的操作介绍
湿转(一般是恒压转印,100V,时间2h左右):转印缓冲液,三明治结构 ,底层海绵,蛋白电泳槽批发,往上依次是3-4层滤纸,凝胶,膜,3-4层滤纸,海绵
海绵和滤纸在使用前要用转移液浸泡,在制作三明治结构时一定要避免凝胶干燥,滤纸内的气泡要用玻璃棒赶走
膜在用之前都要活化,PVDF膜要先浸泡5S-30s,在转移缓冲液中平衡,目的是活化膜上的正电基团,NC膜直接在转移液中平衡即可
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电泳实验技术原理
电泳实验的技术原理
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电泳是带电颗粒在电场作用下,向着与其电荷的电极移动的现象。在一定pH条件下,每一种分子都具有特定的电荷(种类和数量)、大小和形状,在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。
带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。
电泳时,带电颗粒(球形)在介质中受力平衡匀速运动,则有:
v = F阻/f = FE/f = E·q/f = E·q/(6π·r·η)
v — 泳动度 F阻 — 颗粒所受阻力
E — 电场强度 q — 颗粒所带电荷
r — 颗粒半径 η — 介质黏度
FE — 颗粒所受电场力 f —摩擦系数
由上式可见:泳动度与球形分子半径、介质粘度、颗粒所带电荷以及电场强度有关。 非球形分子(如线状DNA)在电泳过程中受到更大的阻力,即粒子的泳动度与粒子形状有关。
影响电泳实验泳动速度的重要因素——支持物
电泳实验多在固体支持物上进行,使样品中的不同组分形成不同的区带,蛋白电泳槽,称区带电泳。电泳结束后,支持物可以方便地进行染色等后续处理。
对支持物的一般要求是均匀,吸附力和电渗小,机械性能好,便于染色或紫外光下检测。常用支持物有SDS——PAGE凝胶,琼脂糖凝胶、滤纸,醋酸纤维素薄膜等, 支持物性质不同也会影响泳动速率,如琼脂糖和聚酰胺凝胶都有大小不同的筛孔,在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快,则慢。
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